D. Yu. Ryazantsev ، E. M. Chudinova ، L. Yu. Kokaeva ، S. N. Elansky ، P. N. Balabko ، G. L. Belova ، S. K. Zavriev
قارچ فیتوپاتوژنیک Colletotrichum coccodes باعث ایجاد بیماری های خطرناکی در سیب زمینی و گوجه فرنگی می شود که به آنتراکنوز و لکه سیاه غده معروف است. با ویژگی های مورفولوژیکی ، تشخیص آنها از بیماری های ناشی از سایر میکروارگانیسم ها اغلب دشوار است. در میوه های گوجه سبز ، این بیماری ممکن است بدون علامت باشد ، فقط در میوه های قرمز رسیده خود را نشان می دهد. برای تشخیص سریع و دقیق پاتوژن ، یک سیستم تست PCR در زمان واقعی ارائه می شود. برای ایجاد یک سیستم آزمایش ، توالی نوکلئوتیدی ژن گلیسرول تری فسفات دهیدروژناز 45 سویه C. coccodes جدا شده از غده های سیب زمینی در مناطق مختلف روسیه تعیین شد.
بر اساس نتایج به دست آمده و تجزیه و تحلیل توالی های مشابه گونه های دیگر موجود در پایگاه داده GenBank ، آغازگرها و کاوشگرهای مخصوص گونه ها برای C. coccodes طراحی شدند. برای بررسی ویژگی سیستم آزمایش ایجاد شده ، PCR با DNA جدا شده از کشت خالص 15 گونه مختلف قارچ انگلی و ساپروتروف در ارتباط با گیاهان گوجه فرنگی و سیب زمینی (Fusarium oxysporum ، F. verticillium ، Phomopsis Phaseoli ، Alternaria alternata ، Helminthosporium solani ، Colletotrichum coccodes) انجام شد. Phellinus ferrugineovelutinus ، Stemphylium vesicarium ، Helminthosporium solani ، Phomopsis Phaseoli ، Neonectria radicicola ، Rhizoctonia solani ، Penicillium sp. ، Cladosporium fulvum ، C. cladosporioides). حضور DNA coccodes Colletotrichum در یک چرخه آستانه 20-27 مشخص شد ، در حالی که گونه های دیگر پس از 40 چرخه شناسایی شدند یا تشخیص داده نشدند. سیستم آزمایش امکان شناسایی قابل اعتماد غلظت DNA coccodes DNA را بیش از 0.01 ng / mm3 در مخلوط PCR تجزیه و تحلیل شده ایجاد می کند. با استفاده از سیستم آزمایش توسعه یافته ، وجود C. coccodes در برگ های گوجه فرنگی با علائم بیماری های قارچی و در غده های سیب زمینی بدون علائم خارجی بیماری مورد بررسی قرار گرفت. برگها با علائم عفونت قارچی از دو زمینه مختلف در منطقه کراسنودار ، غده ها - از مزارع در مناطق Kostroma ، مسکو ، کالوگا ، نیژنی نووگورود جمع آوری شدند. یک برگ گوجه فرنگی حاوی C. coccodes DNA در منطقه کراسنودار پیدا شد. حضور قابل توجهی از DNA این پاتوژن در 5 نمونه از غده های رشد یافته در مناطق Kostroma ، مسکو ، کالوگا مشاهده شد.
معرفی
قارچ های تیره Colletotrichum فیتوپاتوژن های خطرناکی هستند که بر غلات ، سبزیجات ، گیاهان ، میوه های چند ساله و گیاهان توت تأثیر می گذارند. Colletotrichum coccodes (والر) یکی از گونه های همه گیر این جنس است.
هیوز ، عامل آنتراکنوز و لکه سیاه سیب زمینی و گوجه فرنگی است و باعث بیماری تعدادی از گیاهان دیگر از خانواده Solanaceae می شود. علفهای هرز (Dillard، 1992). C. coccodes تمام قسمتهای زیرزمینی گیاه ، پایه های ساقه ، برگها و میوه ها را آلوده می کند (Andrivon et al.، 1998؛ Johnson، 1994). در پوست غده های سیب زمینی آلوده ، ایجاد لکه های خاکستری با لبه های نامشخص برجسته مشاهده می شود ، که بر روی آنها نقاط سیاه اسپور و میکرواسکلروتیا به وضوح قابل مشاهده است. در حین ذخیره سازی ، ممکن است زخم هایی با محتوای نرم شده در پالپ غده ها ایجاد شود ، یعنی این بیماری وارد مرحله آنتراكنوز می شود كه البته بسیار نادر است.
در همان زمان ، علائم آنتراكنوز (زخم های پوستی با نقاط سیاه كوچك) در میوه های گوجه فرنگی مشخص است. روی برگها ، علائم C. coccodes به صورت لکه های قهوه ای تیره ظاهر می شود ، که معمولاً با بافت زرد محدود می شوند (جانسون ، 1994).
ایجاد لکه سیاه روی غده ها ظاهر آنها را خراب می کند ، که به ویژه در هنگام فروش سیب زمینی های پوست قرمز شسته شده مشخص می شود. لایه برداری پوست منجر به تبخیر بیش از حد و افزایش تلفات ذخیره سازی می شود (Hunger، McIntyre، 1979). آسیب به سایر اندام های گیاهی منجر به از دست دادن عملکرد می شود ، که هم در زمین باز و هم در زمین مشاهده شد (جانسون ، 1994 ؛ Tsror و همکاران ، 1999). بیماری های ناشی از C.coccodes تقریباً در همه مناطق تولید کننده سیب زمینی جهان از جمله روسیه رایج است (Leesa، Hilton، 2003؛ Belov et al، 2018). کنترل این بیماری ها به دلیل ناکارآمدی کافی قارچ کش های موجود در برابر C. coccodes و کمبود انواع مقاوم دشوار است (Read، Hide، 1995).
تلقیح C.coccodes می تواند در غده های بذر باقی بماند (Read، Hide، 1988؛ Johnson et al.، 1997) ، دانه های گوجه فرنگی (بن-دانیل و همکاران ، 2010) ، برای مدت طولانی در خاک ، روی بقایای گیاه زنده بمانند (Dillard، 1990 Dillard ، Cobb ، 1993) و در علفهای هرز (Raid ، Pennypacker ، 1987). آثار تعدادی از نویسندگان (Read، Hide، 1988؛ Barkdoll، Davis، 1992؛ Johnson et al.، 1997؛ Dillard، Cobb، 1993) نشان داده اند که پیشرفت بیماری در سیب زمینی و گوجه فرنگی تا حد زیادی به وجود تلقیح در دانه و خاک بنابراین ، برای به حداقل رساندن تلفات ناشی از بیماری ، لازم است (از جمله کمی) تکثیر قارچ در ماده بذر ، خاک ، غده سیب زمینی دانه و دانه های گوجه فرنگی که برای ذخیره سازی گذاشته شده است ، تشخیص داده شود. تشخیص مورفولوژیکی در خاک و مواد گیاهی تنها با وجود میکروسکلروتیا قابل انجام است ، اما در انواع دیگر قارچ ها نیز وجود دارد.
علائم موجود در غده ها بسیار شبیه پوسته نقره است که توسط قارچ Helminthosporium solani ایجاد می شود. جداسازی Colletotrichum coccodes و Helminthosporium solani به یک فرهنگ خالص بسیار دشوار است و به دلیل رشد کند در یک ماده مغذی ، مدت زمان زیادی طول می کشد. برای شناسایی سریع کوکدهای Colletotrichum ، استفاده از روش های تشخیصی ابزاری ضروری است. راحت ترین روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و اصلاح آن است - PCR در زمان واقعی. در حال حاضر ، یک سیستم آزمایشی ایجاد شده توسط محققان انگلیسی (کالن و همکاران ، 2002) برای منطقه ITS1 rDNA در اروپا و ایالات متحده استفاده می شود. استفاده از آن نتایج خوبی را در تجزیه و تحلیل جدا شده های روسی نشان داده است (Belov et al، 2018). با این حال ، C. coccodes بسیار متغیر است و تشخیص آن از یک توالی DNA می تواند منجر به نتایج منفی کاذب شود. برای یک تشخیص قابل اعتماد تر ، تجزیه و تحلیل برای چندین توالی DNA خاص گونه مورد نیاز است ، در ارتباط با آن ما یک سیستم آزمایش اصلی ایجاد کرده ایم که اجازه می دهد تا C. coccodes را با توالی ژن گلیسرآلدئید-3-فسفات دهیدروژناز شناسایی کنید.
مواد و روش ها
برای ارزیابی کارایی و ویژگی سیستم های آزمایش ایجاد شده ، ما از کشت خالص 15 گونه قارچ جدا شده توسط نویسندگان از نمونه های بیماری برگ و میوه گوجه فرنگی ، غده های سیب زمینی استفاده کردیم (جدول 1). برای جداسازی ، اندام های گیاهان با علائم عفونت قارچی ، بیش از یک اندام در هر بوش ، گرفته شد.
یک تکه غده همراه با پوست ، یک تکه میوه گوجه فرنگی و یک برگ آسیب دیده زیر میکروسکوپ دو چشمی قرار گرفت و پس از آن میسلیوم ، هاگ ها یا یک تکه بافت به یک محفظه آغار (آگار مخمر) در یک ظرف پتری با سوزن تشدید کننده برش داده شده منتقل شد. جدايه ها بر روي شيب آگار در لوله هاي آزمايش در دماي 4 درجه سانتي گراد نگهداري شدند.
نمونه هایی از برگ های گوجه فرنگی برای تجزیه و تحلیل با علائم بیماری های قارچی بلافاصله پس از برداشت (در مزرعه) در الکل اتیلیک 70٪ قرار گرفتند و در آنها تا زمان جداسازی DNA نگهداری شدند. غده های سیب زمینی به آزمایشگاه تحویل داده شدند ، از آنها پوست (قطعه 2 × 1 سانتی متر) پوست گرفته و در دمای 20- درجه سانتیگراد منجمد شدند. تا زمان جداسازی DNA به صورت یخ زده ذخیره می شود.
فرهنگ خالص قارچ برای جداسازی DNA در محیط نخود مایع رشد داده شد. میسلیوم قارچ از محیط مایع خارج شد ، روی کاغذ فیلتر خشک شد ، در نیتروژن مایع منجمد شد ، همگن شد ، در بافر CTAB انکوباتور شد ، با کلروفرم خالص شد ، با مخلوط ایزوپروپانول و استات پتاسیم 0.5 میلی متر رسوب کرد و دو بار با الکل 2٪ شستشو داد. DNA حاصل در آب دیونیزه حل شده و در دمای 70- درجه سانتیگراد ذخیره می شود (کوتوزووا و همکاران ، 20). غلظت DNA با استفاده از کیت کمی سازی HS DNA برای DNA دو رشته ای در Qubit 2017 اندازه گیری شد (کیاگن ، آلمان). نمونه های الکلی و منجمد در نیتروژن مایع منشعب شدند ، سپس استخراج DNA همانطور که در بالا توضیح داده شد انجام شد (برای میسلیوم کشت های قارچی خالص).
جدول 1. منشأ سویه های قارچ مورد استفاده
نام قارچ | گیاه ، اندام | محل انتخاب |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1 ، C. coccodes 2 ، C. coccodes 3 ، Ilyonectria crassa ، Rhizoctonia solani | غده سیب زمینی | منطقه Kostroma ، غده های سیب زمینی از نسل اول مزرعه ، رقم قرمز اسکارلت |
کوکتد Colletotrichum 4 | برگ سیب زمینی | هرزه. ماری ال ، یوشکار-اولا |
Helminthosporium solani | غده سیب زمینی | منطقه ماگادان ، pos. چادر ، غده سیب زمینی |
کلادوسپوریوم فولووم | برگ گوجه فرنگی | منطقه مسکو ، گوجه فرنگی میوه دار |
آلترناریا توماتوفیلا | میوه گوجه فرنگی | ارائه شده توسط کارکنان آزمایشگاه قارچ شناسی و فیتوپاتولوژی م Instituteسسه تحقیقات گیاهان روسیه |
Fusarium verticillium ، Phomopsisphaseoli ، Alternaria alternata ، Phellinus ferrugineovelutinus ، Stemphylium vesicarium ، Cladosporium cladosporioides ، Acrodontium luzulae ، Penicillium sp. | میوه گوجه فرنگی | منطقه کراسنودار ، منطقه کریمسکی ، کرم درجه یک |
فوزاریوم اکسی اسپوروم | ریشه گندم | منطقه مسکو |
PCR بر روی یک تقویت کننده DTprime (DNA-Technology) انجام شد. برای PCR ، از آغازگرهای اصلی و یک کاوشگر برای منطقه خاص گونه ژن گلیسرول تری فسفات دهیدروژناز استفاده شد: آغازگر رو به جلو Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA ، آغازگر معکوس Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. آغازگرها یک منطقه 213 جفت باز را تقویت می کنند.
این واکنش 50 نانوگرم DNA کل (در تجزیه و تحلیل برگ ها و غده ها) و 10 نانوگرم (در تجزیه و تحلیل DNA کشت های خالص قارچ ها) را به خود اختصاص داد. مخلوط واکنش (35 میکرولیتر) توسط یک لایه پارافین به دو قسمت جدا شد: قسمت پایین (20 میکرولیتر) حاوی 2 میکرولیتر 10 buff بافر واکنش (750 میلی مولار Tris-HCl ، pH 8.8 ؛ 200 میلی مولار (NH4) 2SO4 ؛ 25 میلی مولار MgCl2 ؛ 0.1 T توئین- 20) ، 0.5 میلی متر از هر تری فسفات دی اکسینوکلئوتید ، 7 بعد از ظهر از هر آغازگر و 4 بعد از ظهر از یک پروب فلورسنت قابل هیدرولیز ؛ بالایی حاوی 1 میکرولیتر بافر 10 × PCR و 1 یونیت پلیمراز Taq بود.
جداسازی مخلوط با پارافین باعث می شود که لوله ها برای مدت طولانی در دمای 5 درجه سانتیگراد نگهداری شوند و پس از 10 دقیقه گرم شدن در دمای بالاتر از 80 درجه سانتیگراد ، یک شروع گرم برای PCR فراهم می کند. PCR طبق برنامه زیر انجام شد: 94.0 درجه سانتیگراد - 90 ثانیه (1 چرخه) ؛ 94.0 درجه سانتیگراد - 30 ثانیه 64.0 درجه سانتیگراد - 15 ثانیه (5 دوره) 94.0 درجه سانتیگراد - 10 ثانیه 64.0 درجه سانتیگراد - 15 ثانیه (45 دوره) 10.0 درجه سانتیگراد - ذخیره سازی
نتایج و بحث
توالی ژن گلیسرول تری فسفات دهیدروژناز در 45 سویه جدا شده از برگ ، ساقه ، غده سیب زمینی و میوه های گوجه فرنگی تعیین شد (Kutuzova ، 2018) در مناطق مختلف روسیه. توالی های مورد مطالعه از همه سویه ها به 2 گروه تقسیم شدند که در دو نوکلئوتید متفاوت بودند. توالی های نوکلئوتیدی نمایندگان هر دو گروه با شماره های KY496634 و KY496635 در GenBank رسوب کرده اند.
آغازگرهای coc70gdf ، coc280gdr و کاوشگر cocgdz طراحی شده بر اساس آنها با استفاده از برنامه BLAST بررسی شد (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) در تمام توالی های ژن گلیسرول تری فسفات دهیدروژناز از گونه های تیره Colletotrichum و موجودات دیگر موجود در پایگاه داده GenBank.
هیچ منطقه DNA از موجودات دیگر بسیار همولوگ با آغازگرها و کاوشگرها یافت نشد.
حساسیت سیستم آزمایش با استفاده از نمونه هایی با غلظت های مختلف DNA coccodes DNA ، DNA برگ سیب زمینی آلوده به آنتراكنوز (جمع آوری شده در سال 2017 در Mari El ، واریته قرمز اسکارلت) و پوست غده های آسیب دیده از لکه سیاه (در منطقه Kostroma جمع آوری شد) بررسی شد اسکارلت قرمز ، جدول 2). برای تأیید وجود DNA در غده ها و برگ های سیب زمینی ، سویه های C. coccodes از آنها به کشت های خالص جدا شد.
نتایج تجزیه و تحلیل حساسیت سیستم آزمایش نشان می دهد که اگر محتوای کل آن در مخلوط PCR بیش از 0.05 نانوگرم باشد ، می توان از آن برای تشخیص موفقیت آمیز DNA coccodes DNA استفاده کرد. این برای تشخیص کاملاً کافی است ، زیرا یک اسکلروتیا به طور متوسط حاوی 0.131/0.04 نانوگرم و یک اسپور حاوی حدود 2002/2002 نانوگرم DNA است (کالن و همکاران ، 34). سیستم آزمون توسعه یافته توسط گروه انگلیسی (Cullen و همکاران ، 0.05) حساسیت مشابهی را نشان داد (چرخه آستانه 37 در 0.005 نانوگرم DNA و XNUMX در XNUMX نانوگرم).
تجزيه و تحليل نمونه هاي طبيعي حاوي C. coccodes در همه موارد اين امكان را فراهم كرد كه به طور قابل اعتماد حضور آن در نمونه آشكار شود (جدول 2) روش پیشنهادی برای جداسازی DNA برای تجزیه و تحلیل نمونه های طبیعی گیاه نیز قابل استفاده بود.
جدول 2. تعیین حساسیت سیستم تست پیشنهادی برای شناسایی کوکتدهای Colletotrichum برای PCR در زمان واقعی
نمونه زکت | مقدار DNA در نمونه * ، ng | چرخه آستانه | C. تشخیص کوکد |
---|---|---|---|
کوکد Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
پوست غده 1 | 50 | 32 | + |
پوست غده 2 | 50 | 30 | + |
پوست غده 3 | 50 | 31.5 | + |
برگ سیب زمینی | 50 | 29.5 | + |
توجه داشته باشید. * در مخلوطی از محصولات PCR.
ویژگی سیستم آزمایش بر روی نمونه های DNA استخراج شده از 15 گونه قارچ مورد آزمایش قرار گرفت. نویسندگان تمام گونه های قارچ را از میوه ها و برگ های گوجه فرنگی ، غده های سیب زمینی آسیب دیده و سالم جدا کردند. یک سویه از ریشه گندم جدا شد (جدول 1). در میان گونه های جدا شده از سطح میوه ، گونه هایی نیز وجود دارند که برای گوجه فرنگی بیماری زا نیستند (به عنوان مثال ، Phellinus ferrugineovelutinus).
مطالعات نشان داده است كه DNA coccodes C. در یك چرخه آستانه 20-27 تشخیص داده شد ، در حالی كه سایر گونه های قارچی پس از چرخه 40 تشخیص داده نشده و یا سیگنالی به آنها داده شد كه می تواند به اثر نویز غیر اختصاصی نسبت داده شود (جدول 3).
جدول 3. بررسی سیستم آزمایش انواع قارچ ها
نام قارچ | چرخه آستانه |
کوکد Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. کوکد 2 | 22.6 |
C. کوکد 3 | 23 |
C. کوکد 4 | 22 |
فوزاریوم اکسی اسپوروم | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
ریزوکتونیا سولانی | > 40 |
Phomopsis Phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
فلینوس فروژینوولوتینوس | > 40 |
استمفیلیوم وزیکاریوم | > 40 |
ایلیونکتریا کراسا | > 40 |
کلادوسپوریوم کلادوسپوریوئیدها | > 40 |
C. فولووم | > 40 |
آکرودنتیوم لوزولا | > 40 |
قارچ کپکی سبز SP. | > 40 |
توجه داشته باشید. * مقدار DNA در همه نمونه ها 10 نانوگرم بود.
از سیستم آزمون توسعه یافته برای شناسایی C. coccodes در نمونه های برگ گوجه فرنگی با علائم پاتوژن های نکروزان و غده های سیب زمینی دانه ای بدون علائم قابل مشاهده استفاده شد. برای مطالعه ، ما غده های بذری از انواع مختلفی را که در مناطق Kostroma ، Moscow ، Kaluga ، Nizhny Novgorod رشد کرده اند ، برداشتیم. وجود DNA coccodes C. در نمونه ها قابل توجه در نظر گرفته شد ، که در تجزیه و تحلیل آن چرخه آستانه از 35 تجاوز نمی کند. این مقدار آستانه بر اساس تعیین اطمینان 0.05 نانوگرم از C. coccodes DNA (چرخه آستانه 33.5 ، جدول 2) و این واقعیت که چرخه های آستانه بالای 40 ، DNA غیر اختصاصی برخی از گونه های دیگر قارچ تشخیص داده شد. با استفاده از این روش ، حضور قابل توجهی از DNA coccodes C. در 5 نمونه غده رشد یافته در مناطق Kostroma ، مسکو ، کالوگا و در یک برگ گوجه فرنگی از منطقه Yeisk در منطقه کراسنودار تشخیص داده شد (جداول 4 ، 5).
جدول 4: شناسایی کوکدهای Colletotrichum روی غده های سیب زمینی *
شماره نمونه | انواع سیب زمینی | محل رشد | C. تشخیص کوکد | چرخه آستانه |
---|---|---|---|---|
1 | قرمز مایل به قرمز | منطقه Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | سانته | منطقه مسکو | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | ژکوفسکی اوایل | منطقه مسکو | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | مولی | کالوگا منطقه است. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | فانتزی | کالوگا منطقه است. | - | |
15 | جشن | منطقه نیژنی نووگورود. | - | |
16 | - |
توجه داشته باشید. * مقدار DNA در همه نمونه ها 50 نانوگرم بود.
جدول 5. تشخیص Colletotrichum coccodes بر روی برگ های گوجه فرنگی *
شماره نمونه | محل رشد | C. تشخیص کوکد | چرخه آستانه |
---|---|---|---|
1 | قلمرو کراسنودار ، منطقه کریمه | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | منطقه کراسنودار ، منطقه ییسک | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* مقدار DNA در همه نمونه ها 50 نانوگرم بود.
سیستم آزمایشی ایجاد شده توسط ما از نظر حساسیت و ویژگی کمتر از آن نیست که محققان انگلیسی (کالن و همکاران ، 2002) توسعه داده اند و برای تجزیه و تحلیل نمونه های گیاهی مناسب است. کاربرد آن برای تجزیه غده های بذر امکان شناسایی DNA coccodes DNA در غده ها بدون علائم خارجی آسیب و تجزیه و تحلیل موفقیت آمیز عفونت برگ ها را فراهم کرد.
تا به امروز ، هیچ تجزیه و تحلیل غده سیب زمینی برای آلودگی به C. coccodes در روسیه انجام نشده است. اولین مطالعه ما نشان داد که از 16 غده بذر آزمایش شده که در مناطق مختلف فدراسیون روسیه رشد کرده اند ، 5 مورد حاوی C. coccodes هستند. این نشان می دهد که لکه سیاه غده سیب زمینی یک بیماری شایع سیب زمینی در روسیه است و نقش آن در کاهش حجم و کیفیت محصول سیب زمینی دست کم گرفته می شود.
تجزیه و تحلیل برگ های گوجه فرنگی حضور قابل توجهی از DNA coccodes DNA را در یک برگ از منطقه Yeisk در منطقه کراسنودار نشان داد. پیش از این ، هنگام بررسی مزارع گوجه فرنگی در جنوب روسیه با استفاده از سیستم آزمایش انگلیس (Cullen و همکاران ، 2002) ، برگهای حاوی C. coccodes پیدا شد ، و در برخی زمینه ها نسبت زیادی از برگهای آلوده به C. coccodes پیدا شد (Belov و همکاران ، 2018) در سرزمین های کراسنودار و پریمورسکی ، منطقه مسکو ، میوه های گوجه فرنگی را یافتیم که از آنها موفق به جداسازی فرهنگ خالص C. coccodes شد. ممکن است C. coccodes در روسیه نسبت به آنچه که اکنون تصور می شود بسیار گسترده تر در گوجه فرنگی باشد و مضر بودن آن نیز دست کم گرفته شود.
بنابراین ، تا به امروز ، اطلاعات کافی در مورد توزیع گسترده C.coccodes بر روی سیب زمینی و گوجه جمع شده است.
برای درک بهتر نقش این قارچ در ایجاد بیماری های سیب زمینی و گوجه فرنگی ، نظارت گسترده بر شیوع آن در روسیه ، بررسی نقش عفونت خاک و بذر و نقش لکه سیاه در تلفات حین ذخیره سازی مورد نیاز است. استفاده از تشخیص PCR می تواند به طور قابل توجهی این کار را تسهیل کند و استفاده همزمان از هر دو سیستم آزمون به طور قابل توجهی دقت تجزیه و تحلیل را افزایش می دهد.
این کار توسط کمک مالی بنیاد علمی روسیه به شماره 18-76-00009 پشتیبانی شد.
مقاله در مجله "Mycology and Phytopathology" (جلد 54 ، شماره 1 ، 2020) منتشر شد.