بخور Chudinov ، V.A. پلاتونوف ، A.V. الکساندرووا ، S.N. الانسکی
اخیراً نشان داده شده است که قارچ ascomycete Ilyonectria crassa قادر به آلوده شدن غده های سیب زمینی است. این کار برای اولین بار به تجزیه و تحلیل ویژگی های بیولوژیکی و مقاومت در برابر برخی از قارچ کش ها از سویه I. crassa جدا شده از سیب زمینی می پردازد. توالی مناطق خاص گونه سویه "سیب زمینی" با آنهایی که قبلاً برای قارچهای جدا شده از ریشه گل نرگس ، جینسینگ ، گیاه گوزن و راش ، پیاز سوسن و برگهای گل لاله به دست آمده همزمان است. ظاهراً بسیاری از گیاهان وحشی و باغی می توانند ذخیره گاه I. crassa باشند. سویه مورد بررسی برش های گوجه فرنگی و سیب زمینی را آلوده کرد ، اما میوه میوه گوجه فرنگی یا غده سیب زمینی سالم را آلوده نکرد. این نشان می دهد که I. crassa یک انگل زخم است. ارزیابی مقاومت در برابر فلودیوکسونیل ، دیفنوکونازول و آزوکسی استروبین بر روی یک ماده مغذی ، تأثیر بالای این داروها را نشان داد.
شاخص EC50 (غلظت قارچ کش ، که 2 برابر سرعت رشد شعاعی کلنی نسبت به کنترل غیر قارچ کش کاهش می یابد) برابر 0.4 بود. به ترتیب 7.4/4 و XNUMX میلی گرم در لیتر. هنگام ارزیابی فیتوپاتولوژیک غده های سیب زمینی و توسعه اقدامات حفاظت گیاه ، باید احتمال توسعه بیماری ناشی از I. crassa در نظر گرفته شود.
توسعه میکروارگانیسم های فیتوپاتوژنیک منجر به تلفات زیادی در تمام مراحل رشد و ذخیره سیب زمینی می شود. هنگام برنامه ریزی اقدامات حفاظتی ، به عنوان یك قاعده ، عوامل بیماری زای شناخته شده ای از جمله گونه های جنس Alternaria ، Fusarium ، Phoma ، Helminthosporium ، Colletotrichum ، Phytophthora و غیره در نظر گرفته می شوند. با این وجود ، در سال های اخیر ، گزارش های بیشتری در مورد ظهور میكروارگانیسم های فیتوپاتوژن جدید روی سیب زمینی منتشر شده است. زیست شناسی آنها ضعیف مورد مطالعه قرار گرفته است ، اثر قارچ کشهای مورد استفاده در سیب زمینی در ارتباط با آنها ناشناخته است ، روشهای تشخیصی توسعه نیافته اند. با توسعه انبوه ، آنها می توانند صدمات قابل توجهی به محصول سیب زمینی وارد کنند. یکی از این میکروارگانیسم ها قارچ ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous است که برای اولین بار توسط نویسندگان روی غده های سیب زمینی کشف شد (Chudinova et al.، 2019).
این کار نتایج تجزیه و تحلیل سویه I. crassa جدا شده از غده های سیب زمینی را ارائه می دهد. ریخت شناسی مستعمرات و ساختارهای میسیلی I. crassa ، توالی نوکلئوتیدی مناطق DNA گونه های خاص ، حدت به سیب زمینی و گوجه فرنگی و مقاومت در برابر برخی از قارچ کشهای محبوب مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها
ما از سویه I. crassa 18KSuPT2 جدا شده در سال 2018 از غده سیب زمینی آلوده رشد کرده در منطقه Kostroma استفاده کردیم. غده تحت تأثیر یک نوع پوسیدگی خشک با حفره ای پوشیده از میسلیوم قهوه ای روشن قرار گرفت. با استفاده از یک سوزن کاهنده استریل ، میسلیوم قارچ به یک ظرف پتری با محیط آگار (آبجو 10٪ ، آگار 1.5٪ ، پنی سیلین 1000 U / ml) منتقل شد. صفحات در تاریکی در دمای 24 درجه سانتیگراد انکوبه شدند.
از میکروسکوپ نوری Leica DM2500 با دوربین دیجیتال ICC50 HD و میکروسکوپ دو چشمی Leica M80 با دوربین دیجیتال IC80HD (Leica Microsystems ، آلمان) برای عکاسی ، ارزیابی اندازه و ریخت شناسی اسپور و اندام هاگ ها استفاده شد.
برای جداسازی DNA ، میسلیوم قارچ در محیط نخود مایع رشد داده شد ، سپس در نیتروژن مایع منجمد شد ، همگن شد ، در بافر CTAB انکوبه شد ، با کلروفرم خالص شد و دو بار با الکل 2٪ شستشو شد.
روش استخراج DNA به طور مفصل در مقاله Kutuzova و همکاران شرح داده شده است. (2017)
برای تعیین گونه ها با استفاده از روش های مولکولی و مقایسه آنها با سایر سویه های شناخته شده I. crassa ، PCR با آغازگرهایی انجام شد که باعث افزایش مناطق DNA ویژه گونه ها می شود: ITS1-5,8،2S-ITS5 (آغازگرهای ITS4 / ITS1990 ، وایت و همکاران ، 2) ، مناطق ژنی b -tubulin (Bt2a / Bt1995b ، Glass ، Donaldson ، 1) و فاکتور طویل شدن ترجمه 1α (tef1α) (آغازگرهای EF728-1F / EF986-1999R ، Carbone و Kohn ، 3.1). با استفاده از کیت Evrogen CleanUp ، آمپلیکون هایی با طول مورد نظر از ژل استخراج شد. مناطق تقویت شده با استفاده از BigDye® Terminator v3730 Kit Sequency Sequency (Applied Biosystems، CA، USA) در یک توالی سنج خودکار Applied Biosystems 6 xl (Applied Biosystems، CA، USA) توالی یابی شدند. توالی های نوکلئوتیدی حاصل برای جستجوی تطبیق در بانک اطلاعاتی GenBank مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ایالات متحده (NCBI) مورد استفاده قرار گرفت. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک با استفاده از برنامه MEGA 2013 انجام شد (تامورا و همکاران ، XNUMX).
تعیین حدت بر روی میوه های کامل سبز گوجه فرنگی میوه دار (رقم دوبراوا) و غده های سیب زمینی (رقم گالا) انجام شد. علاوه بر این ، برای شبیه سازی آسیب به میوه ها و غده های آسیب دیده ، از برش های همان میوه ها و غده ها استفاده کردیم. برش غده ها را در محفظه های مرطوب قرار داده بودند ، که ظروف پتری با کاغذ فیلتر مرطوب در پایین آن بودند. یک اسلاید روی کاغذ قرار داده شد ، که به نوبه خود ، تکه های غده یا میوه بر روی آن قرار گرفت. غده ها و میوه های کامل نیز در ظروف با کاغذ صافی مرطوب در پایین قرار داده شدند. در مرکز خلال (یا روی سطح سالم غده یا میوه) ، یک تکه آگار (5 × 5 میلی متر) با هیف های قارچی پس از 5 روز رشد روی آگار مخمر قرار داده شد.
ارزیابی مقاومت سویه های قارچ به قارچ کش ها در شرایط آزمایشگاهی روی محیط مغذی آگار انجام شد. ما حساسیت به داروهای قارچ کش Maxim ، KS (ماده فعال فلویدیوکسونیل ، 25 گرم در لیتر) ، کوادریس ، KS (آزوکسیستروبین 250 گرم در لیتر) ، Scor ، EC (دیفنوکونازول 250 گرم در لیتر) را مطالعه کردیم (ایالت کاتالوگ ... ، 2020). ارزیابی در ظروف پتری در محیط ورت آگار با افزودن داروهای مورد مطالعه در غلظت ماده فعال 0.1 انجام شد. یکی 1 ppm (میلی گرم در لیتر) (برای فلویدیوکسونیل و دیفنوکونازول) ، 10 ؛ ده ppm 1 (برای آزوکسیستروبین) و در محیط بدون قارچ کش (شاهد). قارچ کش به ماده مذاب اضافه شده و در محیط 10 درجه سانتیگراد خنک شد و پس از آن محیط در ظروف پتری ریخته شد. یک بلوک آگار با میسلیوم قارچ در وسط ظرف پتری قرار داده شد و در دمای 100 درجه سانتیگراد در تاریکی کشت داده شد. بعد از 60 روز انکوباسیون ، قطر کلنی ها در دو جهت عمود بر هم اندازه گیری شدند. نتایج اندازه گیری برای هر کلنی به طور متوسط انجام شد. این آزمایش ها در سه تکرار انجام شد. بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل ، EC24 محاسبه شد ، برابر با غلظت قارچ کش ، که سرعت رشد شعاعی کلنی را نسبت به کنترل قارچ کش به نصف کاهش می دهد.
نتایج و بحث
روی ظروف پتری با آگار مخمر ، قارچ کلنی هایی با میسلیوم لخته سفید تشکیل داد. محیط زیر میسلیوم به رنگ قهوه ای مایل به قرمز در آمد. هنگامی که محیط خشک می شود ، قارچ از اسپورودوکیای کوچک از دو نوع اسپور در دو کندیوفور منفرد و تجمع یافته تشکیل می دهد. ماکروکنیدیا کشیده ، استوانه ای ، دارای یک تا سه سپتوم ، طول متوسط 27.2 میکرومتر با دامنه مقادیر از 23.2 تا 32.2 میکرومتر ، عرض - تا 4.9 میکرومتر است (شکل 1). طول متوسط میکرونیدیا 14.3/10.3 میکرومتر با دامنه مقادیر از 18.1/4.0 تا 2012/XNUMX میکرومتر است ، عرض آن تا XNUMX/XNUMX میکرومتر است. همه شخصیت های کلان و میکرو مورفولوژیکی در محدوده تنوع گونه های Ilyonectria crassa قرار می گیرند (Cabral و همکاران ، XNUMX).
توالی مناطق DNA گونه های خاص (ITS ، b-tubulin ، TEF 1α) کاملاً با توالی سویه های I. crassa که قبلاً مورد مطالعه قرار گرفتیم همخوانی دارد (Chudinova et al.، 2019، Table 1). برای مطالعه شیوع I. crassa در مناطق دیگر و تجزیه و تحلیل طیف فرهنگهای تحت تأثیر ، توالی DNA مشابه در پایگاه داده GenBank مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (جدول 1). همپوشانی 86 تا 100 درصد بود. توالی هر سه منطقه DNA سویه "سیب زمینی" I. crassa با توالی سویه های جدا شده از پیاز سوسن و ریشه گل نرگس در هلند و از ریشه جینسینگ در کانادا یکسان بود. ما موفق به یافتن سایر گونه های I. crassa با سه توالی مشابه آنالیز شده در پایگاه داده های باز نشدیم. با این حال ، تجزیه و تحلیل توالی های ITS و b-tubulin رسوب شده وجود I. crassa را روی برگ های گل لاله در انگلستان نشان داد. قارچ ها با توالی ITS مشابه در تجزیه و تحلیل مایکوبوتای ریشه های گیاه Aspen در کانادا و ریشه های راش در ایتالیا ، غده های سیب زمینی در عربستان سعودی مشخص شدند (جدول 1). نتایج این مطالعه نشان می دهد که I. crassa توزیع جهانی دارد و قادر است انواع مختلف گیاهان را آلوده کند.
هنگام تعیین بیماریزایی برشهای گوجه فرنگی و سیب زمینی در روز 5 ، قطر ضایعه به 1.5 سانتی متر رسید. سویه مورد بررسی کل میوه گوجه فرنگی و غده سیب زمینی سالم را آلوده نکرد. با این حال ، کاسبرگها روی گوجه فرنگی تأثیر گذاشتند. برای جلوگیری از احتمال آلودگی ، یک جدایه قارچی از میسلیوم تولید شده در یک برش غده سیب زمینی در یک فرهنگ خالص جدا شد. کاملاً شبیه فشار والدین بود. ظاهراً ، I. crassa انگل زخم است.
تیمار غده بذر با قارچ کش قبل از کاشت باعث کاهش بیماریها در گیاهان در طول فصل رشد می شود. برای انتخاب قارچ کشهای موثر ، ارزیابی اینکه کدام یک از آنها در برابر I. сrassa موثر هستند مهم است. این کار مواد فعال گسترده قارچ کش - فلودیوکسونیل ، آزوکسی استروبین ، دیفنوکونازول را مطالعه کرد. فلویدیوکسونیل در چندین مخلوط وجود دارد که برای پانسمان بذرها و غده های بذر قبل از کاشت استفاده می شود. از فلویدیوکسونیل (ماکسیم) برای درمان غده های بذر قبل از ذخیره سازی نیز استفاده می شود. دیفنوكونازول و آزوكیستروبین همچنین در تعدادی از آماده سازی های مورد استفاده برای فرآوری مواد بذر و همچنین در آماده سازی هایی كه برای پردازش گیاهان رویشی استفاده می شوند ، وجود دارد (State catalog ...، 2020).
میزان رشد I. crassa روی محیط (شکل 2) با غلظت های مختلف مواد فعال مورد مطالعه قرار گرفت: فلودیوکسونیل (EC50 = 0.4 ppm) ، آزوکسی استروبین (EC50 = 4 ppm) و دیفنوکونازول (EC50 = 7.4 ppm) (جدول 2). این آماده سازی ها را می توان در برابر I. crassa بسیار م consideredثر دانست ، زیرا EC50 آنها به طور قابل توجهی پایین تر از غلظت توصیه شده آماده سازی در مایع کاری است که برای درمان غده استفاده می شود. طبق Catalogue State ... (2020) ، غلظت فلویدیوکسونیل در مایع برای درمان غده های سیب زمینی از 500 تا 1000 ppm ، آزوکسی استروبین (در مایع برای درمان قسمت زیرین شیار) - 3750-9375 ppm ، دیفنوکونازول (در مایع برای درمان گیاهان رویشی) - 187.5– ppm 625
جدول 1. شباهت توالی توالی های گونه های خاص سویه 18KSuPT2 و سویه های Ilyonectria crassa موجود در بانک اطلاعاتی Genbank
نژاد | گیاه میزبان ، محل دفع | اعداد توالی سپرده شده در GenBank ، درصد شباهت ها | پیوند | ||
ITS | β-توبولین | TEF 1α | |||
17KSPT1 و 18KSuPT2 | غده سیب زمینی ، منطقه Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova و دیگران ، 2019 ، این اثر |
CBS 158/31 | ریشه گل نرگس ، هلند | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral و همکاران ، 2012 |
CBS 139/30 | لامپ سوسن ، هلند | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | ریشه جینسینگ ، کانادا | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | برگ لاله ، انگلستان | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | دنتون ، دنتون ، 2014 |
MT294410 | ریشه های Aspen ، کانادا | MT294410 100 | ND | ND | رامسفیلد و دیگران ، 2020 |
ER1937 | راش ، ایتالیا | KR019363 99.65 | ND | ND | تیزانی ، هاگی ، موتا. تسلیم مستقیم |
KAUF19 | غده سیب زمینی ، عربستان سعودی | HE649390 98.3 | ND | ND | گشگری ، قرباوی ، 2013 |
ND = واریز نشده است
جدول 2. مقاومت Ilyonectria crassa در برابر قارچ کش ها
(ماده شیمیایی فعال) | EC50 ، ppm | ||||
روز 3 | روز 5 | روز 7 | |||
کنترل | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
کوادریس ، KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
ماکسیم ، KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
اسکور ، EC (دیفنوکونازول) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
در کار ما ، سویه های I. crassa از غده های سیب زمینی در مناطق Kostroma و Moscow (Chudinova et al.، 2019) جدا شدند. هنگام تجزیه و تحلیل مایکوبایوتای غده های سیب زمینی در عربستان سعودی ، نسبت بالایی از سویه های قارچی با توالی ITS یکسان با I. crassa مشخص شد (گشگری و قرباوی ، 2013). ظاهراً I. crassa در سیب زمینی آنچنان که به نظر می رسد نادر نیست. آزمایش های ما نشان داد که این قارچ می تواند میوه های آسیب دیده گوجه فرنگی را آلوده کند. از ادبیات شناخته شده است که I. crassa قادر به رشد ساپروتروفیک در خاک است (مول و همکاران ، 2016) ، و همچنین بر انواع گیاهان ، حتی گیاهان دور از نظر طبقه بندی مانند گل نرگس ، نیلوفرها ، جینسینگ ، گل مینا و راش تأثیر می گذارد (جدول 1). یکی) ظاهراً بسیاری از گیاهان وحشی و باغی می توانند ذخیره گاه I. crassa باشند. موارد فوق نشان می دهد که هنگام ایجاد اقدامات محافظتی ، لازم است که احتمال تأثیر غده سیب زمینی با این قارچ را در نظر بگیریم. آماده سازی گسترده برای درمان غده های سیب زمینی حاوی فلودیوکسونیل ، آزوکسی استروبین و دیفنوکونازول اثر قارچ کش زیادی در برابر I. crassa نشان داده است.
این کار توسط بنیاد تحقیقات بنیادی روسیه (گرانت شماره 20-016-00139) پشتیبانی شد.
مقاله در ژورنال "گیاهان حفاظت گیاهان" ، 2020 ، 103 (3) منتشر شده است